O museu ocupa uma grande área do mosteiro domenicano de São Marcos e conserva ainda a sua atmosfera quase que intacta. Fundado no ano de 1436 e realizado de acordo com o projeto do arquiteto preferido de Cosimo Il Vecchio, Michelozzo, o mosteiro teve um papel importante na vida religiosa e cultural da cidade de Florença. 

A fama do mosteiro é devida principalmente as obras de Beato Angélico, um dos maiores pintores do Renascimento florentino, o qual afrescou diversos ambientes do mosteiro.  Persogens importantes viveram no mosteiro, entre eles Santo Antonino e Girolamo Savonarola.

Outras pinturas de Fra Angelico, de diversas fontes, foram recolhidas no século XX, de modo que o museu oferece atualmente uma documentação original do pintor.

 
Igualmente importantes são as coleções do século XVI, com obras de Fra Bartolomeo, e uma seção dedicada aos artefatos dos edifícios demolidos no centro da cidade de Florença no século XIX.

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